2型糖尿病（T2DM）是由机体细胞对胰岛素正常作用抵抗引起，被公认为世界上最严重的公共卫生问题之一 。目前，有研究表明α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是T2DM的治疗靶点。近年来，基于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抗高血糖药物已被开发出来。然而，这些有各种副作用，因此，从自然资源中寻找新的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是当前食品和药品领域的一个重要新方向。

　　目前有研究发现没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有良好的抑制效果，但没有深入研究其具体的抑制机制。因此西北农林科技大学食品科学与工程学院的沈荷玉, 李梦阳，罗安伟*等从酶动力学、紫外光谱、荧光猝灭、圆二色谱（CD）以及分子模拟这些方面研究没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制机理，以期为提高富含没食子酸的植物性食物和药食同源的中草药资源利用提供新思路，为开发含有没食子酸的降血糖药物或保健食品提供有益参考。

　　如图1所示，随着没食子酸质量浓度的增加，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用显著增强，这表明没食子酸对酶活性的抑制作用具有显著的剂量依赖性。没食子酸和阿卡波糖（阳性对照物）对α-淀粉酶的IC50 分别为（0.72±0.01）mmol/L和（0.31±0.02）mmol/L，对α-葡萄糖苷酶的IC50分别为（0.59±0.02）mmol/L和（0.08±0.01）mmol/L。虽然与阿卡波糖相比，没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果略低，但依旧有良好的抑制效果。因此，没食子酸是潜在的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶。

　　如图2A所示，不同底物质量浓度所对应直线相交且交点在横坐标轴上，与纵坐标截距变大，可知Km 值不变，而Vmax 呈下降趋势，表明没食子酸以非竞争方式抑制α-淀粉酶。因此推断没食子酸与α-淀粉酶活性中心以外的氨基酸残基进行结合，底物质量浓度不影响没食子酸对α-淀粉酶的抑制作用。如图2B所示，不同底物质量浓度所对应直线象限，与纵坐标截距变大，与横坐标截距变小，可知Km 值增大，而Vmax呈下降趋势，表明没食子酸以混合竞争方式抑制α-葡萄糖苷酶，能与底物竞争α-葡萄糖苷酶的活性中心结合位点。这与阿卡波糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用类型分别为混合竞争性抑制和竞争性抑制 不同，可能是在化学结构上的差异导致抑制效果和类型不同，具体原因仍需进一步研究。

　　如图3所示，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶在270 nm附近有一个特征峰，主要是由于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸残基的存在引起。如图3所示，随着没食子酸质量浓度的增加，特征峰的位置没有明显移动，但α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的吸收峰强度大大增加。吸收峰强度变化具有浓度依赖性，该现象表明α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶-没食子酸复合物的形成可能有利于分子间和分子内聚集，破坏了芳香族氨基酸残基的微环境空间结构，导致酶的构象变化和疏水基团的暴露。

　　如图4所示，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶分别在343 nm和336 nm波长处出现最大荧光峰。随着没食子酸质量浓度的增加，酶的荧光强度逐渐下降。此外，α-淀粉酶的最大荧光发射波长位置发生轻微蓝移，而α-葡萄糖苷酶的最大荧光发射波长发生红移。结果表明没食子酸能够通过与酶的相互作用强烈地猝灭α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的固有荧光，氨基酸残基的微环境发生了变化。没食子酸对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭过程为静态荧光猝灭，而不是由分子碰撞引起的动态荧光猝灭。

　　如图5A、C所示，α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的荧光光谱图有3 个特征峰，分别为Ray-leigh散射峰（峰a）和光谱特征峰（峰1和峰2）。峰1表示酶中Tyr和Trp残基涉及π→π*转变的光谱特征，峰2表示多肽主链C＝O涉及n-π*转变的荧光光谱特征 。如图5B、D所示，加入没食子酸后，峰1和峰2峰强度明显降低。图5D中α-葡萄糖苷酶的三维荧光光谱中峰2甚至消失。峰的变化表明没食子酸通过形成没食子酸-酶复合物影响α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶多肽链的微环境，没食子酸倾向于通过诱导疏水基团和侧链的折叠提供疏水区域，从而导致酶的构象转化。

　　如图6所示，在208 nm和226 nm波长处的负峰分布在π-π*跃迁和n-π*跃迁中，分别表征α-螺旋和β-折叠 。与游离的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶CD光谱相比，没食子酸的加入降低了酶在208 nm和226 nm波长处的负峰强度。结果表明，没食子酸可以显著影响α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的二级结构。由表1可知，随着没食子酸含量的增加，α-淀粉酶中α-螺旋结构含量（25.10%～19.70%）减少，而β-折叠结构含量（22.60%～28.00%）、β-转角结构含量（18.20%～19.80%）和无规卷曲结构含量（40.20%～44.80%）增加；α-葡萄糖苷酶中α-螺旋结构含量（43.40%～27.00%）减少，β-折叠结构（12.70%～21.30%）、β-转角结构（15.20%～18.10%）和无规卷曲结构含量（25.80%～36.90%）增加。因此，加入没食子酸可以破坏α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的二级结构，从而降低酶结构的稳定性，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性。

　　分子对接结果表明，没食子酸与α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶相互作用，最低结合能分别为－5.9 kcal/mol和－6.5 kcal/mol。结合能为负值表明α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶可能与没食子酸形成复合物。在分子对接中，没食子酸定位在α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性位点附近。如图7B和图8B所示，没食子酸与α-葡萄糖苷酶结合时，主要被Lys156、Asn235、Ser236、Thr237、Phe314、Asn317、Ile419、Glu422、His423、Glu429、Lys432、Phe433等氨基酸残基所包围，且与氨基酸残基Lys156、Asn317、Glu422、His423、Glu429之间形成5 个氢键。没食子酸的苯环上含有3 个羟基，苯环上的电子离域作用促使酚羟基发生离子化，易与酶的结合形成氢键，氢键的形成可以增强α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和配体分子结合的稳定性 。以上结果表明，氢键和疏水作用是没食子酸与α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶之间重要相互作用，可以改变酶的空间结构，对其抑制活性有重要影响。

　　本研究探讨了没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并采用抑制动力学、紫外光谱法、荧光光谱法、CD光谱法和分子对接分析研究了没食子酸和2 种酶之间的相互作用机理。没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有良好的抑制作用，且抑制作用都具有明显的浓度依赖性。酶促反应动力学结果显示，没食子酸分别以非竞争性抑制方式和混合竞争性抑制方式与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性位点相互作用。紫外光谱分析结果表明，没食子酸的加入导致酶的构象变化和疏水基团的暴露。荧光谱图结果显示，没食子酸以静态猝灭的方式强烈猝灭酶的内源性荧光，改变了氨基酸残基Trp和Tyr所处的微环境。CD光谱分析表明，没食子酸显著改变酶的二级结构，从而导致酶构象发生变化。同时，采用分子对接的方式模拟没食子酸与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的结合，没食子酸通过与周围氨基酸残基相互作用，导致酶的构象发生紊乱，从而降低α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的催化活性。综上所述，没食子酸可以良好抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，有效减缓碳水化合物消化，降低血糖水平。该研究为没食子酸在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶领域的深层次研发利用提供一定参考。

　　本文《没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用及机理》来源于《食品科学》2023年44卷第22期31-38页，作者：沈荷玉, 李梦阳, 敖婧芳, 王 军, 徐怀德, 罗安伟。DOI:10.7506/spkx0116-132。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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