鱼类含有丰富的蛋白质和不饱和脂肪酸，是人类重要的食品原料，但鱼类会引起过敏反应，严重威胁人类的健康。鱼类过敏是对鱼体中抗原物质产生的不良反应，是八大食物过敏原之一。而鲢鱼是我国四大家鱼之一，具有重要的经济和食用价值，但鲢鱼及其鱼糜制品中主要过敏原小清蛋白（PV）引起的过敏反应威胁着许多人的健康，如何消减鲢鱼PV的致敏性是食品安全领域急需解决的科学问题。

　　江西师范大学生命科学学院，国家淡水鱼加工技术研发专业中心的陈文美、刘 俊*等以鲢鱼PV为研究对象，选用半乳糖和焦磷酸钠先后对其进行共价修饰，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、圆二色谱和光谱等技术分析改性前后鲢鱼PV多级结构的变化；运用高分辨质谱技术对糖基化联合磷酸化修饰的鲢鱼PV进行修饰肽段和位点表征；同时采用酶联免疫吸附法（ELISA）、嗜碱性粒细胞细胞系（KU812）模型评价糖基化联合磷酸化修饰的鲢鱼PV与IgG/IgE的结合能力以及对KU812细胞释放组胺（HIS）和白介素-6（IL-6）的能力。

　　如图1所示，与N-PV相比，H-PV的蛋白质条带没有发生明显变化，而Gal-PV、SP-PV和Gal-SP-PV的条带发生向上迁移，尤其是Gal-SP-PV条带向上迁移最为明显。该结果表明鲢鱼PV与半乳糖和磷酸基团共价交联形成高分子质量物质，导致蛋白条带向上迁移。

　　如图2所示，与N-PV相比，H-PV的游离氨基含量改变不显著，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的游离氨基含量显著降低（P＜0.05）。结果表明，鲢鱼PV发生糖基化和磷酸化。此外，Gal-SP-PV的游离氨基含量最低，其次是Gal-PV和SP-PV，这是由于更多氨基酸被糖基化和磷酸化修饰。

　　如表1所示，N-PV的二级结构中，α-螺旋相对含量为57.29%，β-折叠相对含量为7.78%，β-转角相对含量为12.48%，无规卷曲相对含量为22.46%。与N-PV相比，H-PV的α-螺旋和β-转角的相对含量比例较高，分别为60.45%和17.97%，而β-折叠和无规卷曲的比例较低。有研究表明α-螺旋含量的增加主要由β-折叠的降低引起。结果表明，长时间加热会在一定程度上破坏鲢鱼PV的氢键网络，引起蛋白质多肽链的部分扩张。此外，在SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV中，α-螺旋的比例呈不断下降趋势（P＜0.05），而β-折叠和β-转角的相对含量比例呈现相反的趋势。该结果表明，糖基化联合磷酸化修饰的鲢鱼PV二级结构相对含量发生明显改变，主要表现为α-螺旋相对含量的降低和β-折叠相对含量的增加。蛋白质的二级结构靠氨基酸序列和分子内不同区域的相互作用而维持，而糖基化联合磷酸化会明显破坏这些相互作用，从而导致PV的二级结构发生变化。

　　如图3所示，与N-PV相比，H-PV的荧光强度降低，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的荧光强度显著降低，降低程度为SP-PV＜Gal-PV＜Gal-SP-PV。荧光强度的降低可能是由于蛋白质与还原糖和磷酸基团的接入使PV的色氨酸区域被屏蔽，从而导致其产物的荧光强度降低。结果表明，PV经磷酸化、糖基化和糖基化联合磷酸化修饰后空间结构被破坏，破坏的程度为糖基化联合磷酸化＞糖基化＞磷酸化。当PV发生美拉德反应后，赖氨酸或精氨酸的氨基与还原糖发生反应，其二级结构或结构发生改变，从而影响了抗原表位的结合活性。

　　为了更好地阐明糖基化联合磷酸化修饰对鲢鱼PV一级结构的影响，采用质谱对SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的修饰位点的数量和位置进行鉴定，结果如图4和表2所示。图4a、c显示77ALTDAETKAFLK88和29SFFAKVGLSAK39的m/z分别为735.39242＋和658.85953＋。通过b和y离子值之间差值（图4b、d），可以确定多肽77～88和29～39氨基酸序列中的修饰位点分别为K84和K33（表2）。类似地，通过相同的糖基化方法鉴定了SPPV、Gal-PV和Gal-SP-PV上的修饰位点。如表2可知，Gal-PV含有8 个修饰位点，分别为K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108。在SP-PV中发现了2 个磷酸化位点（S56和S92）。其中，Gal-SP-PV具有与Gal-PV相同的8 个糖基化位点外，还含有一个与SP-PV相同的磷酸化位点（S56）。结果表明，糖基化联合磷酸化修饰的鲢鱼PV含有最多的修饰位点。

　　图5b为鲢鱼PV的IgE结合能力，可观察到与IgG结合能力类似的趋势。同一样品与不同患者血清的IgE结合能力存在一定差异，但总体而言，H-PV的吸光度高于N-PV，而SP-PV、Gal-PV和Gal-SP-PV的吸光度低于N-PV。如图5b所示，鲢鱼PV的IgE结合能力在加热后显著增强（P＜0.05），而经糖基化、磷酸化和糖基化联合磷酸化修饰后，IgE结合能力下降，下降趋势为SP-PV＜Gal-PV＜Gal-SP-PV。这些结果表明，糖基化联合磷酸化修饰能够降低鲢鱼PV的IgG/IgE结合能力。

　　如图6所示，与对照组比，N-PV、Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV和H-PV的HIS和IL-6含量增加，说明鲢鱼PV的添加影响过敏症状相关介质的释放。与N-PV相比，Gal-PV、SP-PV、Gal-SP-PV的HIS和IL-6释放量低，其中Gal-SP-PV的释放量显著低于N-PV（P＜0.05）。可能的原因是糖基化联合磷酸化修饰的鲢鱼PV诱导嗜碱性粒细胞脱颗粒的程度较弱，减弱了效应细胞分泌HIS等生物活性介质能力，而炎症性介质会在一定程度上引起以毛细血管扩张、平滑肌收缩等为特点的病理变化，从而诱发身体局部或全身过敏反应。这与图5结果一致。结果表明，糖基化联合磷酸化修饰的鲢鱼PV降低KU812细胞HIS和IL-6分泌，降低其过敏反应。

　　PV是鲢鱼及其鱼糜制品中的主要过敏原，如何降低其致敏性具有重要的意义。通过各种物理和化学方法破坏过敏蛋白的抗原表位降低其致敏性是目前行之有效的脱敏技术。本研究中选用半乳糖和焦磷酸钠先后对鲢鱼PV进行共价修饰，与单独Gal-PV和SP-PV相比，糖基化联合磷酸化修饰能显著降低其致敏性，如IgG和IgE结合能力的降低（图5）、KU812细胞中HIS和IL-6含量的减少（图6）。

　　本研究中，与单独糖基化和磷酸化相比，半乳糖和磷酸基团先后与鲢鱼PV共价结合可以增加其分子质量（图1），显著降低游离氨基含量（图2），改变二级结构（表1）和构象结构（图3），这些结构的变化会破坏鲢鱼PV的构象过敏表位，从而降低其致敏性。如图7所示，糖基化联合磷酸化修饰的PV不仅含有与Gal-PV相同的8 个糖基化位点（K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108），还包含1 个与SP-PV相同的磷酸化位点S56。

　　综上所述，与单一的糖基化或磷酸化修饰相比，糖基化联合磷酸化修饰能够显著降低鲢鱼PV的致敏性。糖基化联合磷酸化修饰能增加鲢鱼PV的分子质量和糖基化修饰位点，而游离氨基含量和内源荧光吸收强度显著减少，这些结果表明糖基化联合磷酸化修饰能显著改变鲢鱼PV的抗原表位；同时糖基化联合磷酸化修饰降低了鲢鱼PV与IgE/IgG的结合能力以及对KU812细胞脱颗粒（HIS和IL-6）的释放能力。这说明糖基化联合磷酸化修饰通过破坏鲢鱼PV的抗原表。