利用全基因组测序、分子对接和密度泛函理论方法研究了来源于开菲尔谷物中分离出的植物乳杆菌12-3 （Lactiplantibacillus plantarum 12-3）将亚油酸（LA）转化为脂肪酸（FA）代谢物过程、涉及主要反应和相关酶类。通过全基因组分析，L. plantarum 12-3被归类为植物乳杆菌种的一员，具有良好的保存性和分类亲缘性。采用子系统技术对基因组进行快速注释，揭示了功能子系统以及代谢途径、细胞活性和毒力因子。这项工作为L. plantarum 12-3菌株的潜在应用价值和独特特性提供了依据。

　　肠道微生物组在调节宿主细胞代谢过程中起着重要作用，其中最显著的是脂质代谢、葡萄糖代谢和体内平衡。肠道菌群产生的某些代谢物，如脂质代谢物和信号分子，在增强宿主免疫力和功能，维持健康的肠-脑-肝轴，预防由微生物生态失调引起的炎症性肠病和肥胖等疾病中发挥着重要作用。在肠道微生物组中，乳酸菌（LAB）在食品加工中有着悠久的使用历史，通常被认为是安全的状态，它们通常具有许多有益的健康作用。LAB可产生多种抗菌化合物，包括乙酸、苯乳酸、环二肽、3-羟基脂肪酸、多肽等。研究人员发现乳酸菌可以将亚油酸（LA）等多不饱和脂肪酸（PUFAs）转化为对细菌无毒的各种生物活性脂肪酸代谢物。这些代谢物在影响脂质代谢的年龄相关变化和分布模式方面起着至关重要的作用。因此，了解和调节肠道菌群的脂质代谢途径是改善人类健康的重要途径。

　　最近，研究人员发现一些肠道细菌及其代谢物可能改变脂质代谢，包括脂质产生、吸收和储存，可能影响整体代谢健康和肥胖、心血管疾病等疾病的发展。乳酸杆菌属中，植物乳杆菌常见于消化道，可作为动物饲料的发酵剂，也可作为人类的膳食补充剂。在我们之前的研究中证实了从开菲尔分离的Lactiplantibacillus plantarum 12-3 在LA添加量为1%~10%的培养基中能够将LA转化为共轭亚油酸（CLA）和不同的脂肪酸代谢物，但转化机制尚不清楚。

　　利用B3LYP/ 6-311G**++软件对从LA中提取的5 种脂肪酸进行计算研究（表1），利用密度泛函理论（DFT）对植物乳杆菌12-3基因组进行进一步评估。图1为优化后化合物的HOMO、LUMO和MEP。HOMO和LUMO被称为“FMOs”，分别由供电子和接受电子决定，这可能决定了乳酸杆菌与LA激酶结合的途径。利用FMO能距计算了分子的化学反应性和动力学稳定性。DG与亲电试剂直接相关。LA对所有测试的脂肪酸都显示出最有希望的软化酶。μ−和ω−反映出从到激酶的电子转移量。

　　静电电位表面的颜色变化表明其值的变化。散射力表示为蓝色，引起电子给能。橙色、和红色表示与电子接受负电荷有关的吸引力。绿色代表经过静电电位表面测试的对激酶的吸收效率较高（图1）。

　　L. plantarum12-3菌株与其他已识别的植物乳杆菌菌株之间的相似性水平采用平均核苷酸同一性（ANI）分析确定（图2）。热图直观地描述了L. plantarum12-3菌株与参考菌株在基因上的相似性。根据L. plantarum12-3的ANI值对菌株进行聚类，从而鉴定出亲缘关系较近的菌株。结果表明，L. plantarum12-3菌株无疑是L. plantarum物种的成员，也显示出高度的保守性和分类亲缘性。这些结果使我们对L. plantarum12-3菌株的分类鉴定和遗传亲缘关系有了新的认识。有助于更好地了解L. plantarum12-3在植物乳杆菌种内的遗传背景，并支持L. plantarum12-3作为植物乳杆菌种成员的认定。

　　采用快速注释利用子系统技术（RAST）注释服务对目标生物基因组进行注释。注释过程揭示了关于基因组功能内容的有用信息，并突出了许多子系统统计和基因组特征。基于注释，病理系统资源整合中心（PATRIC）注释服务器将预测的基因分组为功能子系统。基因在不同功能类别间的分布由子系统统计量显示（图3）。

　　L. plantarum 12-3中有多种酶负责将LA转化为不同的代谢物，并且这种转化是通过不同的反应完成的。L. plantarum 12-3将LA转化为脂肪酸类似物的最重要反应是脱氢、异构化和还原。检测到了3 种假设的酶（图4）。

　　脱氢酶在脱氢过程中起着循环作用。参与该脱氢机制的活性位点氨基酸残基包括ASP11、CYS14、GLN15、THR18、GLU145、ASN146、TYR147、 MSE149和LYS150。所有被测化合物均成功地与脱氢酶结合口袋对接。被测脂肪酸的COOH基团分别与活性位点的重要氨基酸通过键锁模式相互作用：Gln245和Arg189、Gly214和Gln215、Arg189、Lys188、Tyr248和Arg189（图5）。

　　计算机测键锁理论假设：所有分离的脂肪酸都是通过脂肪酸酸性基团的OH与酶结合袋的氨基酸之间形成氢键来封住脱氢酶结合袋。H-相互作用对脱氢生物转化至关重要，因为其加速了黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）与底物的反应。随后，在酶的机制过程中，FAD转化为FADH2, FADH2在亚油酸作为底物中形成新的双键。在这种情况下，脱氢依赖于FAD。所测化合物的结合袋排列为亚油酸、硬脂酸、2-氨基-1,3-十八烷二醇、9-反,12-反-十八烷二酸和辛基十二烷（表2）。

　　计算机分析表明，亚油酸异构酶催化L. plantarum12-3将LA的Z,Z转化为E,Z（图6）。亚油酸异构酶依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），将LA双键转化为单键，并可逆地反转构型（图4）。所有化合物通过与锌离子螯合包埋活性位点，形成稳定的八面体形状。亚油酸的结合效率最高（－9.15 kcal/mol）。对LA异构酶的结合效率排列为：2-氨基-1,3-十八烷二醇、辛基十二烷、9-反,12-反-十八烷二酸和硬脂酸。

　　L -谷胱甘肽和胰硫蛋白是在L.plantarum12-3中发现的两种可能的亲核试剂，它们将L-谷胱甘肽还原成两种具有单键的不同化合物，即6-/9-十八烯酸。还原机制依赖于NADPH（图7）。谷胱甘肽和胰硫蛋白亲核试剂在第一阶段与LA形成复合物，NADPH在第二阶段对LA的作用导致还原。通过与活性位点残基的诱导配合对接，我们可以看到LA与His3和Glu145的羧基之间形成了两个氢键。与LA形成重要的氢键，用于催化底物。2-氨基-1,3-十八烷二醇的结合活性最强，而其他化合物的结合能几乎相同，约为－6.6 kcal/mol。

　　经过分子对接和DFT研究证实，L.plantarum 12-3将LA转化为各种脂肪酸代谢物的主要反应有脱氢、异构化和还原。通过子系统统计显示了参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢和其他关键代谢功能等代谢过程的基因的存在。这些发现表明了目标生物的代谢适应性。此外，注释结果揭示了独特的基因组性状信息。这些特征包括发现参与多种生物活动的基因，如DNA复制、转录、翻译和细胞壁构建。此外，注释强调了与应激反应，运输系统和毒力因子相关的基因的存在，表明生物体的适应性和潜在毒性。这些代谢物非常重要，可以用于进一步的研究。这些代谢物的活性和生物功能特性可以通过体内和体外方法进一步证实。

　　杨贞耐，男，北京工商大学食品与健康学院二级教授，博士生导师，国务院政府特殊津贴专家，“新世纪百千万人才工程”国家级人选，第二届中国乳品加工业“十大杰出科技人物”。获江西农业大学学士学位（1985年）、东北农学院硕士学位（1988年）、芬兰赫尔辛基大学食品科学（乳品技术专业）博士学位（2000年。