高通量测定在药物发现、基因分析及临床诊断等领域发挥重要作用。为了实现高通量目标，超容量编码提供了理想的解决方案：借助同时标记大量目标物的策略，一次性测定目标物的各自功能。目前报道的编码方法多着力于提高编码容量，即实现高通量输入。然而，现实中这类高容量编码可能在整个合成与检测的反应条件下失去稳定性，带来复杂的解码流程与错误的解码结果，从而无法实现高通量输出。因此，实现“高通量输入、高通量输出”的高效测定，急需研究高容量编码信号、合成与功能的三维正交性质。华中师范大学高婷娟研究小组报道了一种正交组合拉曼编码策略，实现了多肽组合库高容量编码信号、合成与功能的三维正交性。相关研究以“Orthogonal Combinatorial Raman Codes Enable Rapid High-Throughput-Out Library Screening of Cell-Targeting Ligands”为题发表在Research上。

　　以常用于药物发现的多肽组合库筛选为例，其采用的化学编码可以在合成与功能测试中保持稳定，但是在原位解码时缺乏信号正交性，所以解码时只能分离阳性珠、进行洗脱后测定氨基酸序列。整个解码过程漫长、昂贵，导致研究者们往往只能选取几个功能较强的阳性珠进行解码，无法分析所有可能序列的结构共性与差异，失去了更多阳性序列的统计信息。相比之下，光学编码法中利用分子振动信息的拉曼编码，可以充分结合特征峰的波长、强度等信号，组合出具备信号正交性的~105容量的编码。但是，自身信号正交的拉曼编码是否也能在合成、功能测试和信号读取中保持稳定不变呢？（图1）

　　（a）高通量输入的编码是否满足信号、合成与功能的正交性，从而实现解码的高通量输出（b）传统化学编码方法与正交拉曼编码方法的比较

　　华中师范大学高婷娟研究小组报道了一种正交组合拉曼编码策略，实现了多肽组合库高容量编码信号、合成与功能的三维正交性。作者研究了大量拉曼信号分子的光谱性质及其在典型合成条件下的化学稳定性，从而确定了编码分子的合理组合。采用固相合成组合化学方法，作者获得了1000种编码多肽的组合库，并且从~12,000个编码树脂珠中，快速解码了与肿瘤细胞结合力各异的所有63个阳性珠，发现了这些多肽序列结构的共性和差异（图2）。

　　作者评估了静默区与指纹区21个拉曼信号分子在5种典型合成反应条件下（活化、亲核/碱、还原/碱、强酸、氧化）的化学稳定性。依据三个波段中拉曼信号的位移信息，每个波段选择两个编码分子的组合，每个组合设计0-9号共10个编码，一共形成了1000个编码。经过合成路线与分配比例的优化后，编码精准达到了预期效果并顺利通过了化学稳定性测试（图3）。

　　（a）三组编码分子的结构。（b）三组编码分子的相对拉曼信号强度。（c）通过分配脱保护比例调节编码信号强度。（d）三组编码的合成比例分配。（e）1000个组合拉曼编码。（f）组合拉曼编码在合成中的化学稳定性。

　　拥有了信号正交、化学稳定的组合拉曼编码，作者紧接着设计了一个在第5、6、7位氨基酸上各10种变化的8-mer环肽聚焦组合库。这1000种多肽序列正好分别对应1000种拉曼编码。然后，多肽组合库与组合拉曼编码的构建整合至同一个合成路线。合成完毕后，编码的多肽组合库置于肿瘤细胞中孵育，并进行原位显微观察与拉曼光谱测量（图4、5）。

　　（a）共聚焦拉曼光谱的原位解码示意图。（b）组合库结合细胞后的大视场显微成像示例（红色箭头处为阳性珠）。（c）阳性珠的拉曼光谱解码示例。

　　作者收集了所有结合U-87MG细胞的阳性珠光谱，通过比对1000种拉曼编码的标准谱图，解析出阳性多肽的氨基酸序列。统计结果表明，第5、6位氨基酸只能是L-Glycine和L-Arginine，而第7位氨基酸存在10种可能性，其中与U-87MG细胞结合概率最大的是L-Glycine（概率35%）。结果说明，组合拉曼编码在功能测试中也保持了稳定性，可以满足信号、合成、功能三个维度的正交性（图6）。

　　综上所述，该研究提出的高容量编码三维正交性研究及其应用示例，为理解高通量筛选“高通量输入、高通量输出”的终极目标提供了新的视角。同时，自多年前拉曼编码用于高通量测定的美好愿望被提出后，此项研究报道终于提供了一个清晰有力的实证。

　　正交组合拉曼编码未来可结合自动化成像、程序光谱采集与标准码比对等仪器开发工作，实现化合物固相组合库的智能高通量检测与筛选，有望为药物发现、基因分析及临床诊断提供“高通量输入、高通量输出”的解决方案。

　　高婷娟，华中师范大学农药与化学生物学教育部重点实验室、化学学院教授，博士生导师。2002年本科毕业于北京大学，2008年在美国罗切斯特大学获博士学位，2008-2011年在加州大学戴维斯分校从事博士后研究。研究领域涉及分子内增强拉曼散射、高灵敏快速多色拉曼成像、超容量拉曼编码，以及分子间相互作用、表界面化学反应、细胞生理过程的原位光电测量。近三年以通讯作者在JACS、ACS Central Science、Chemical Science、Analytical Chemistry等重要学术期刊发表系列研究论文。