肠道不仅具有消化吸收功能，还是机体最大的“天然免疫器官”。环磷酰胺是一种常用的化疗药物，广泛用于治疗血液恶性肿瘤和各种上皮肿瘤。然而大剂量的环磷酰胺会损伤胃肠黏膜，从而导致机体产生免疫缺陷，并增加继发染的风险。目前从大豆、三文鱼、小麦、乳清和胶原蛋白中发现了很多具有免疫调节活性的多肽。有研究发现，鳀鱼（Engraulis japonicus）蛋白水解物可显著减轻动脉粥样硬化及巨噬细胞RAW264.7的氧化应激，而鳀鱼蛋白肽在肠道免疫调节活性方面的研究还鲜有报道。

　　中国海洋大学食品科学与工程学院的刘银媛，汪寒梅，赵雪*等使用超高效液相色谱-高分辨多级质谱联用技术分析鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽组成差异，然后采用环磷酰胺诱导肠黏膜免疫抑制小鼠模型，以大豆蛋白肽为对照，分析比较鳀鱼蛋白肽与大豆蛋白肽对肠道黏膜免疫调节的活性，以期为开发以鳀鱼蛋白肽为主要功能成分的健康食品以及改善化疗药物所致的肠黏膜免疫损伤相关的特医食品提供理论依据。

　　在前期研究中，为了提高蛋白肽的得率，本课题组对鳀鱼蛋白和大豆蛋白的水解条件进行了探索，发现鳀鱼蛋白使用中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解的得率最高，而大豆蛋白肽使用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解的得率最高。因此，以提高蛋白肽得率为目标，筛选出降解鳀鱼蛋白和大豆蛋白的最佳条件，获得了两种不同的蛋白肽产品（文章未发表）。如图1和表2所示，鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的重均分子质量分别为264.150 Da和413.124 Da，鳀鱼蛋白肽的重均分子质量小于大豆蛋白肽。鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽均含有所需的8 种必需氨基酸（赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val））。鳀鱼蛋白肽中谷氨酸（16.95%）、丙氨酸（12.00%）、赖氨酸（9.82%）、色氨酸（6.56%）和谷氨酸（16.95%）相对含量较高，而大豆蛋白肽中亮氨酸（8.08%）、天冬氨酸（9.40%）、亮氨酸（8.08%）、精氨酸（7.17%）和苯丙氨酸（6.35%）相对含量较高。大豆蛋白肽中天冬氨酸、酪氨酸和精氨酸相对含量远高于鳀鱼蛋白肽，丙氨酸和色氨酸相对含量远低于鳀鱼蛋白肽。

　　采用超高效液相色谱-高分辨多级质谱对蛋白肽进行分析，利用Peaks Online 1.7软件分析蛋白肽产品中所有多肽的序列和相对含量。超高效液相色谱能够将6 000 条多肽进行分离，四极杆-轨道阱超高分辨质谱可检测总离子强度为4.79×103～2.67×108的所有多肽。根据多肽的二级质谱，本研究从鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽中分别解析出5 680 条和7 666 条多肽的准确序列。根据维恩分析，鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽中多肽组成的差异如图2和表3所示。分析发现鳀鱼蛋白肽总肽段为5 680 条，2～5肽占比为65.05%；大豆蛋白肽总肽段为7 666 条，2～5肽占比（50.69%）低于鳀鱼蛋白肽，10肽以上的多肽占比（9.76%）高于鳀鱼蛋白肽（4.30%）。两种蛋白肽产品中相同的肽段为1 325 条（占比为11.0%），其中97.9%为2～5肽。鳀鱼蛋白肽中有4 355 条多肽段是其独有的，大豆蛋白肽中有6 341 条多肽段是其独有的。

　　由表4可知，鳀鱼蛋白肽中相对含量较高的多为2～5肽，还有少量的10肽、11肽。而大豆蛋白肽中相对含量较高的多为10肽以上的多肽，与分子质量分析结果相印证。本研究结果说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽种类和相对含量有很大不同。

　　分别给予小鼠100、300 mg/kg mb和500 mg/kg mb的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽30 d后，发现300 mg/kg mb鳀鱼蛋白肽和500 mg/kg mb大豆蛋白肽组小鼠的活动量增多，鼠毛光泽较好；而100 mg/kg mb鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽组小鼠的生命力均较差。如图3所示，通过观察HE切片可以发现，300 mg/kg mb和500 mg/kg mb的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽对小肠黏膜结构的保护效果都较好，没有明显差异。100 mg/kg mb的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽组小鼠的肠黏膜损伤仍比较严重。因此后续实验中采用300 mg/kg mb剂量的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽，比较两种不同蛋白肽的肠黏膜免疫调节作用。

　　在注射环磷酰胺前，各组小鼠均反应灵敏、精神状态良好、鼠毛光亮。如图4所示，正常组小鼠体质量在实验期内缓慢上升，而注射环磷酰胺的模型组小鼠体质量明显低于正常组，同时观察到小鼠懒惰、反应迟钝、活动量减少、鼠毛无光泽。与正常组小鼠相比，模型组小鼠胸腺和脾脏指数均显著降低（P＜0.05），说明环磷酰胺对小鼠机体和免疫器官造成了损伤。补充300 mg/kg m b 鳀鱼蛋白肽/大豆蛋白肽30 d后，虽然小鼠的体质量与模型组相比没有明显差异，但是其活动量增加、鼠毛光泽较好。与模型组相比，大豆蛋白肽可显著提高小鼠的胸腺和脾脏指数（P＜0.05）；鳀鱼蛋白肽可显著提高小鼠的脾脏指数（P＜0.05），但对胸腺指数没有显著影响，说明灌胃鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽可以减轻环磷酰胺诱导的小鼠免疫器官损伤。

　　如图5所示，正常组小鼠小肠绒毛结构完整，排列整齐且连接紧密。而模型组小鼠小肠绒毛矮短、松散，间隙增大，有些绒毛甚至断裂、脱落；同时绒毛长度和绒毛长度/隐窝深度值显著降低（P＜0.05），而隐窝深度显著增加（P＜0.05），说明环磷酰胺对小鼠小肠黏膜结构损伤严重。与模型组相比，300 mg/kg mb鳀鱼蛋白肽组与大豆蛋白肽组小鼠的小肠绒毛结构有所改善，绒毛长度显著增加而且排列较整齐，绒毛长度/隐窝深度显著增加（P＜0.05），隐窝深度显著降低（P＜0.05），说明补充鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽可以改善环磷酰胺对小鼠小肠黏膜结构的损伤，维持小肠的正常组织结构和生理机能，且鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽对小肠黏膜结构的保护效果并没有显著差异。

　　小肠免疫体统中，T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13水平对肠黏膜的免疫功能非常重要。如图6所示，与正常组相比，模型组小鼠小肠免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的表达水平显著下降（P＜0.05），而300 mg/kg m b 鳀鱼蛋白肽组和大豆蛋白肽组小鼠小肠免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的表达水平均显著高于模型组（P＜0.05），且与胸腺肽组接近。说明环磷酰胺能显著抑制T细胞产生相关免疫因子，而鳀鱼蛋白肽与大豆蛋白肽可以改善环磷酰胺对免疫因子分泌的抑制。比较发现，鳀鱼蛋白肽组TNF-α水平显著高于阳性对照胸腺肽组（P＜0.05），说明鳀鱼蛋白肽促进TNF-α因子表达的效果更好。

　　如图7所示，相比于正常组，模型组小鼠小肠黏膜中免疫球蛋白IgA和SIgA的表达水平显著下降（P＜0.05。