导言：尽管目前纳米粒子药物递送在动物及细胞模型研究中展现出较好的前景，但这些纳米药物在临床应用中却十分受限。究其本质，大致原因可归结于纳米药物载体（NDC）功能的夸大、临床前研究结果的局限性、动物模型向应用转化过程中的较大差异，以及人类疾病本身的高度异质性与复杂性等。在纳米药物递送过程中的各种挑战中，最大的难题之一和前提是实现纳米药物向特定靶点、细胞、和疾病组织的高效输送，此外，纳米药物运输机制的不确定性也成为其实现精确控制和提高治疗效果的主要阻碍。
该综述首先对诸如电穿孔、声穿孔、光穿孔、微流控传递和微注射等破细胞膜方法进行了概述，强调了其在体外NDC传递中高通量和提高递送效率方面的优点。后续文章详细阐述了颗粒大小、形状、带电性、亲水性和弹性等NDC特性对细胞摄取的影响，并对几种旨在实现体内分层靶向和传递的NDC系统进行了回顾。此外，文章进一步探讨了新兴的体外人类/动物源病理生理模型，因为它们可能模拟体内传递特征并填补动物到人类之间的转化差距。最后，文章总结了现代显微镜技术在细胞、器官和整体水平上对纳米颗粒（NP）进行精确追踪的方法探索，为定制开发适用于体内应用和临床转化的NDC提供了丰富信息。总体而言，这篇综述汇集了智能纳米系统工程、生理模型、基于成像的验证工具的最新见解，旨在增强NDC的精确高效的细胞内传递。
电穿孔通过电脉冲使细胞膜渗透性增加，形成细胞膜上的孔道，可以实现将外来物质转运到细胞内环境中。现有技术可通过可逆电穿孔（RE）或不可逆电穿孔（IRE）实现暂时性或永久性的细胞膜通透性增加。
通过产生声波来破坏细胞膜，增强纳米颗粒和生物大分子的细胞内传递，称为声穿孔。使用商业微泡可以增强介导的药物传递效果。
光穿孔是一种利用光能破坏细胞膜完整性并改善膜通透性的技术，现已发展为一种有前景的细胞内传递策略，具有多种独特优势。最典型的光穿孔方法是通过激光产生的高强度光能在局部造成胞膜破坏。目前有基于光热、光力学和光化学过程的多种方法，在特定细胞的膜上形成孔道，允许外源性纳米颗粒的内部扩散。
该方法主要是基于快速水流引起的流体剪切力，诱导细胞变形并破坏脂质双层以建立细胞内递送通道。这种方法可以使得细胞在短暂的形变后重新封闭细胞膜，对细胞活力的影响较小，因此可以作为细胞内递送的一种理想的策略。
显微注射是一种将NDC直接传递到活细胞内的方法，相较于内吞作用，显微注射能够精确地将目标物质送入细胞内，避免药物因环境中的低pH和降解性蛋白酶而失活。这种方法能够保持NDC的表面特性，避免渗入内溶酶体的障碍，从而实现颗粒在细胞内的均匀分布。
表面功能修饰或配体封装的纳米粒子系统可以增强细胞对纳米粒子的识别和主动吸收。在功能化表面修饰中，聚乙二醇（PEG）、右旋糖（dextran）和壳聚糖（chitosan）可以增强NDC的细胞相容性，是最常用且最有效的分子。此外，单克隆抗体或抗体抗原结合片段（Fabs）、天然蛋白质或小肽、寡核苷酸以及其他小分子也被用于那么递送系统的表面修饰。
纳米颗粒的大小影响细胞内摄取的效率、途径以及对生物细胞的毒性。直径小于200 nm的纳米颗粒主要通过衬膜介导的内吞作用被细胞摄入，而大于500 nm的纳米颗粒则通过吞噬作用进入细胞。纳米颗粒的聚集会影响细胞内摄取，因此控制纳米颗粒的大小和聚集状态有助于提高递送效率。
纳米颗粒的形状也与细胞内摄取效率相关。有研究表明，棒状纳米颗粒具有更大的表面积与体积比，能够增强与细胞的相互作用，因此比球状纳米颗粒更易被细胞摄取。此外，纵横比增加可能导致细胞难以包裹纳米颗粒，从而降低摄取效率。
纳米颗粒表面电荷的正负会直接影响与细胞膜之间的静电相互作用。带正电荷的纳米颗粒更易与细胞膜结合，通过微小体内摄取，但可能会破坏细胞膜完整性，导致细胞毒性和细胞死亡。
亲水性纳米颗粒更易吸附在脂质双层表面，诱导细胞膜包裹并随后内吞，而疏水性纳米颗粒可以嵌入脂质双层内核。
纳米粒子的弹性可通过杨氏模量评估，杨氏模量高的纳米颗粒更易被细胞摄取。这是因为超软的纳米颗粒在包裹过程中需要消耗更多能量，从而导致细胞内摄取效率降低。
在体内递送，尤其是靶向肿瘤的递送中，可以根据血液循环和肿瘤微环境中不同的酸碱度条件设计由pH触发的可切换表面电荷的NDC递送系统。这种策略使得NDC在血液循环中带负电或中性电荷，但在纳米颗粒到达肿瘤组织表面后能够切换为正电荷，从而增强纳米颗粒与带负电的细胞膜之间的相互作用，增强肿瘤细胞的靶向摄取。
NDC的动态尺寸也是决定其细胞摄取和滞留的关键因素之一。直径在10到100 nm之间的NDC通常可以更好地从血管渗透到肿瘤中，但也在肿瘤摄取中更容易重新进入血液循环。较大尺寸的NDC虽然能在肿瘤细胞的胞质甚至细胞核中具有更好的滞留能力，但无法高效地被靶细胞捕获。设计可变尺寸的纳米颗粒是纳米应用的一个大胆假设。目前可行的策略包括刺激引发的聚集、尺寸减小和超分子共组装。
目前NDC通常被设计为连接一些肿瘤特异性的配体，以促进NDC与肿瘤细胞的相互识别，增强受体介导的内吞作用，包括单克隆抗体、肽和其他小分子等，但与NDC结合的配体可能使得NDC被巨噬细胞清楚，或被正常组织非预期地摄取。为了解决这些问题，现有策略是为NDC构建可脱落的表面，使得其在靶器官外能避免被正常细胞识别，在到达肿瘤组织后暴露肿瘤特异性配体从而增强肿瘤细胞的摄取。
MCTS是通过悬浮细胞自组装构建的3D结构模型，与2D单层培养细胞相比更接近实体肿瘤。MCTS的主要原理是抵抗细胞与基质的相互作用，促进细胞之间的耦合。初始化球体构建的两种主要策略包括：通过在表面涂覆低粘附性涂层的液体重叠，或在培养器盖的下侧悬挂细胞悬浮液。这些方法可以刺激细胞凝聚和增殖，形成3D培养的肿瘤球。
BBB模型用于模拟血脑屏障的生理条件，用于评估针对中枢神经系统疾病的NDC的有效性。这种模型通过在细胞培养皿中使用脑血管内皮细胞（BCEC）构建屏障，与其他类型的细胞相隔，形成模拟血脑屏障的结构。BBB模型可用于研究药物透过屏障的能力、药物释放的速率和效果等相关参数。
气液界面吸入模型用于研究通过呼吸道递送的纳米颗粒。该模型设计将纳米颗粒悬浮在液体介质中，使其在呼吸道或气道阻尼器上形成气液界面，并模拟吸入条件以评估纳米颗粒在肺部组织中的输送效率。
器官微流控芯片模拟器官的微环境，基于微流控技术，在微尺度的芯片上集成细胞、组织和生物体素材，模拟更真实的生理条件，并可以创建具有特定生理功能的微型器官模型。
精确切割组织片是通过将器官或组织切割成薄片的方法来创建模型。这种方法允许维持细胞和组织的原始结构、功能和相对位置，以便更好地模拟整个器官的生理过程。与器官微流控芯片相比，精确切割组织片是一种较为传统的模型，其优点在于更接近真实器官的解剖和生理特征。
聚集诱导发光（AIE）策略主要用于提高NDC以及细胞的荧光强度，以获取高质量的图像。具有AIE特性的荧光物（AIEgens）在分子状态下不发光且荧光很弱，但是AIEgens的聚集可以通过分子内运动限制引起强烈的发光。与无机荧光物负载的纳米粒子相比，封装AIEgens的纳米粒子观察到具有更高的荧光强度和较好的生物相容性。
类似于AIE技术，上转换纳米颗粒（UCNPs）也专注于颗粒修饰以实现超分辨率成像。稀土离子被固定在材料上作为敏化剂和活化剂，在上转换过程中可吸收近红外（NIR）光子并分别接受传输能量，从而产生可见光子以实现发光和成像。UCNPs的明显优势在于其非光漂白和非光闪烁特性，弥补了传统有机染料的不足，并避免了因光漂白的荧光物质导致的质量不佳的图像。此外，由于生物样本对近红外光不活跃的响应，UCNPs几乎不引入自身荧光背景，这使得图像更清晰，广泛应用于生物医学领域。
在这些仪器中，CLSM可以利用相对较窄的景深和点扫描技术排除焦外干扰物，获得横向分辨率更高的图像以及纵向分辨率更高的序列光学切片。然而，激光照射的功率可能会损害细胞的生理行为，而且对固定标本进行预处理也是不可避免的，在解释有关细胞-NP 相互作用的活细胞成像时，应仔细考虑这两个因素。
从结构生物学到纳米科学，电子显微镜（EM）一直是研究细胞-NP 相互作用不可或缺的工具，包括扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）。基于电子显微镜获得的基本信息，如原子周期性、元素组成和电子密度，可客观观察 NPs 的物理形态，包括粒度、表面粗糙度、分散和聚集状态以及纳米材料的微化学成分。
与电子显微镜不同，拉曼显微光谱学是基于单色激光束与样品相互作用引起的光性散射和分子振动，产生代表材料特征的分子键 指纹 光谱，从而无需荧光染色或标记即可识别化学成分和微环境。在二维和三维细胞培养环境中使用的共聚焦拉曼光谱模式还能在亚细胞水平上对固定细胞和活细胞进行体外分析，可以提供有关 NDC 细胞递送的信息。此外，结合 K-means 聚类等多元分。
